生物柴油有以下几种生产方法：
1. 化学法生产，用生物油脂与甲醇或乙醇等低碳醇，并使用氢氧化钠或醇甲钠做为触媒，在酸性或者碱性催化剂和高温下发生酯交换反应，生成相应的脂肪酸甲酯或乙酯，再经洗涤干燥即得生物柴油。
2. 生物酶合成法，用动物油脂和低碳醇通过脂肪酶进行转酯化反应，制备相应的脂肪酸甲酯及乙酯。酶法合成生物柴油具有条件温和、醇用量小、无污染排放的优点。
3. 工程微藻法，美国国家可更新实验室通过现代生物技术建成“工程微藻”，即硅藻类的一种“工程小环藻”，其优越性在于：微藻生产能力高、用海水作为天然培养基可节约农业资源；比陆生植物单产油脂高出几十倍；生产的生物柴油不含硫，燃烧时不排放有毒害气体，排入环境中也可被微生物降解，不污染环境。
4. 废油脂生产生物柴油，原料油脂干燥，将原料油脂加热到120摄氏度，真空脱水干燥，控制原料含水在百分之0.5以下。
生物柴油是一种较为洁净的合成。